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DDT降解菌株Chryseobacterium sp PYR2对小麦的促生作用及其机理

2023-09-24 新闻中心

  双对氯苯基三氯乙烷(DDT)是一类有机氯杀虫剂,也是一种持久性有机污染物,化学性质十分稳定,在土壤中的半衰期较长。DDT残留对生态环境和人体健康造成潜在危害,尽管已禁用多年,但在农田土壤中仍然常检出DDT残留,在我国东部地区农田土壤中的浓度高于西部地区,其中京津冀地区DDT浓度最高

  国内外围绕DDT污染现状及其生物修复技术做了大量的研究,分离到一批能够降解DDT的微生物菌株,研究了相关菌株的降解机理、代谢途径等[3-5]。迄今为止分离到的DDT降解菌主要是通过共代谢方式降解DDT,在降解过程中需要利用其它碳源作为能源,只有少数菌株能够以DDT作为唯一碳源,通过降解DDT进行生长[6-7]。本课题组从长期有机氯农药污染的土壤样品中,通过富集培养和驯化分离筛选出一株DDT降解菌株Chryseobacteriumsp. PYR2,该菌株能够以DDT为唯一碳源进行生长,并将DDT彻底降解脱毒[8]。接种PYR2菌株的污染土壤生物修复实验结果为,PYR2能显著促进污染土壤中DDT的去除,经过45 d的修复,PYR2修复组土壤中80.4%的DDT被降解。上述根据结果得出,菌株PYR2在今后可能应用于有机氯农药污染土壤的微生物修复,具有潜在的应用价值。

  在污染环境的微生物生物修复过程中,接种的降解菌与土著微生物、植物之间有着极为复杂的相互作用,需要考虑土壤修复菌和环境之间的关系。Liu等研究之后发现,植物根系分泌物能加强根际微生物活性,同时微生物活动也有助于释放根系分泌物,二者共同作用促进污染物的降解[9]。张超兰等对有机氯农药六六六污染土壤的研究发现,植物根部释放的酶和根际区微生物的共同作用是土壤中有机氯农药降解的根本原因[10]。目前,国内外关于DDT降解菌在土壤中对植物的影响鲜有报道,而同时具有降解农药如DDT和植物促生双重功效的菌株尚未见报道。菌株PYR2属于金黄杆菌属(Chryseobacterium),有报道表明,该属成员属于植物促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria,PGPR),有些如Chryseobacteriumhispalense能合成吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid,IAA)促进植物根系生长[11-12],有些能分泌蛋白酶、果胶酶、几丁质酶、铁载体,有些还能拮抗植物线]。本研究以DDT降解菌株Chryseobacteriumsp. PYR2为对象,在已有的DDT降解特性研究的基础上,进一步研究该菌株对植物的促生作用及其机理,包括对小麦种子的萌发、小麦植株生长的影响、菌株的植物促生物质及其生物合成途径分析等,以期为开发DDT降解和植物促生双效微生物菌剂与应用提供基础。1 材料与方法1.1 材料

  sp. PYR2由本课题组从受有机氯农药高度污染土壤中分离获得[8]。作物种子小麦采用新乡58品种,由中国农业科学院植物保护研究所提供,当年收获。

  Tryptic Soy Broth,BD公司。多功能微孔板检测仪,Bio-Tek公司;液相色谱-质谱联用仪,Agilent公司;智能人工气候箱,宁波江南仪器厂。1.1.3 培养基

  CFU/mL菌悬液(A1处理)、2×108CFU/mL菌悬液(A2处理)、2×107CFU/mL菌悬液(A3处理),以及无菌水阴性对照(CK1处理)的溶液中,浸种2 h,用纸卷发芽方法,光照培养箱恒温25 ℃,12 h光照/12 h黑暗条件下培养。每个处理组重复4次,每个重复使用100粒种子。小麦种子萌发后第4天统计发芽势,第8天小心取出小麦植株,统计发芽率,观察植株根系发育形态,统计畸变率,分别测定各处理组幼苗的苗高、根长和侧根数。小麦盆栽实验:实验用盆直径约20 cm,每盆加土1.5−2.0 kg,小麦每盆7−8棵苗,播种后取长势一致的幼苗作为研究对象,分别用1×108、1×10

  、1×106CFU/mL浓度的菌悬液灌根处理,并设置无菌水对照处理(CK1),每个处理组重复3次,分别于种子出苗后第18、28、34、40天进行灌溉接种,第65天进行仔细的检测,并统计幼苗株高、鲜重、干重。1.2.3 菌株PYR2产植物促生物质条件研究

  优化条件下菌株生长及IAA合成研究:将PYR2菌株接种于pH 7.0、盐浓度0.5%、L-色氨酸底物浓度50 mg/L的1/10稀释TSB液体培养基中,按1% (体积比)接种量接种菌株后,30 ℃、160 r/min培养,每8 h动态取样,测定菌株的生长情况及IAA含量,每个处理设置3个重复。

  将100 mL 1/10稀释TSB液体培养基(含色氨酸50 mg/L)灭菌后接种活化的PYR2菌,以30 ℃、160 r/min的速率振荡培养,分别在接种后20 h及24 h取样,样品用8 000 r/min离心10 min沉淀菌体,上清用0.22 μm的微孔滤膜过滤后,滤液用稀甲酸调pH 2.5−3.0,用乙酸乙酯萃取,室温下干燥后再用甲醇溶液溶解,微孔滤膜过滤后用HPLC测定滤液中植物促生物质及其中间代谢产物。

  标准品色胺(TAM)、色醇(TOL)、吲哚-3-乙酰胺(IAM)和吲哚-3-乙腈(IAN)分别用甲醇溶解后配制成混合标样,混合标样中每种标准品含量为5×10−7g/L。IAA及其中间代谢产物的提取按参考文献[

  ]所述进行:菌株PYR2发酵液离心去除菌体,上清液用0.22 μm的微孔滤膜过滤后,用乙酸乙酯萃取2次,收集、合并有机相,真空干燥后用甲醇溶解,用于LC-MS分析。LC-MS仪器为安捷伦1260/6460,配电子喷雾电离(ESI)离子阱Mass Spectrometer。运行条件为:二级质谱碰撞电压85 V,碰撞能量25 eV,电喷雾电离(ESI),正离子模式。检测方式:MRM模式。数据分析采用统计软件SPASS V16.0做多元化的分析,计算样本平均值及标准差;用单因素方差分析办法来进行差异性分析,最小显著差(Least significant difference,LSD)在0.05概率水平,确定各个平均值之间的差异显著性。

  、2×108CFU/mL菌悬液处理组的侧根数指标明显高于对照组,比对照组提高了8.7%;但发芽势、发芽率和畸变率指标上,处理组和对照组差异不显著(表 1)。

  检测呈红色,而不接菌的对照则没有这种反应,说明PYR2菌株能利用色氨酸产生IAA。另外,不含色氨酸的培养上清液在比色反应中颜色变化不明显,说明培养基中加入色氨酸能显著增加PYR2菌株合成IAA的量。采用单因素实验法研究了各培养条件,包括温度、pH、盐度以及底物浓度对PYR2菌株生长和IAA产量的影响,结果如图 1所示。

  表明,菌株生长温度在10−37 ℃之间,20 ℃菌株生长最好;但IAA产量与菌株的生长不同,在30 ℃达到最大值11.9 mg/L;当生长温度高于30 ℃,菌体生长量和IAA产量均减少。图 1B表明,初始pH 6.0时菌株几乎不生长;pH为7.0−8.0时菌株生长良好,pH 7.5时OD600值最高为0.720;pH 8.0时菌株生长呈下降趋势。IAA产量则在pH 6.0时随pH上升而缓慢提高,在pH 8.5左右达到最大值10.9 mg/L。图 1C表明,PYR2菌株在盐浓度 0.5% (质量体积比)时,菌体生长量及IAA产量最高,随盐度提高而逐渐下降;当盐浓度 3%时,菌体几乎不生长,也几乎不合成IAA。图 1D表明,在添加不同浓度色氨酸底物时,菌生长几乎不受影响,而IAA的量则在色氨酸浓度 50 mg/L时随其浓度的增大而直线提高,从不加色氨酸时的2.8 mg/L提高到50 mg/L色氨酸时的9.9 mg/L,继续提高色氨酸底物浓度后,IAA的合成量并未随着底物浓度的增大而提高。

  所示。根据结果得出,优化条件下培养8 h后,PYR2菌株进入对数生长期,16 h菌体生长

  600值达到最大值0.940,随后进入稳定期,OD600值有缓慢下降趋势,菌体数量慢慢地减少,进入衰退期;随着培养时间的延长,IAA含量则不断增多,培养16 h以后IAA浓度大于10 mg/L,培养48 h时培养液中IAA为16.4 mg/L,相比上文不同培养条件下的IAA最大产量,优化培养条件后IAA产量提高了约1.5倍;菌体培养至64 h左右,IAA产量达到最大值,浓度为18.3 mg/L。

  )为117.2、144.1处都有对应的特征峰值;标准品IAM和样品在质荷比(m/z)为130.1、158.1处都有对应的特征峰值;标准品IAA和样品在质荷比(m/z)为103.1、130.1处都有对应的特征峰值;标准品TOL和样品在质荷比(m/z)为117.1、144.1处都有对应的特征峰值,表明上清液中含有IAA、TAM、IAM和TOL四种化合物。

  Note: A: IAA; B: TAM; C: IAM; D: TOL.

  对小麦的促生实验根据结果得出,PYR2菌株无论是对小麦种子的发芽,还是对小麦植株的生长都有着非常明显的推动作用,实验组在很多指标上,如苗高、侧根数、株高、鲜重、干重等,相比对照组都显著提高(

   0.05)。需要强调的是,在用该菌株菌悬液浸泡小麦种子时,2×10

  CFU/mL的菌悬液即可达到良好的效果;同样,以1×108CFU/mL菌悬液浇灌小麦新乡58,对其生长的促生效果也最显著,鲜重、干重指标分别比对照组提高了24.7%、36.9%,这些结果充分说明了该菌株对于小麦促生作用的高效性。另外,前期工作表明,该菌株的发酵液细胞密度能够达到约1010CFU/mL (数据未给出),如果用于小麦种子浸泡,则可以稀释约1 000倍,如果用于浇灌则只需0.01%的接种量即可,这些都说明该菌株不论是使用量还是使用成本上都是可接受的,表明其拥有非常良好的实际应用前景。3.2 菌株PYR2产植物促生物质条件的研究单因素实验研究表明,PYR2菌株合成IAA的量受到温度、pH、盐浓度及色氨酸底物的影响,菌体的最适生长温度、pH和合成IAA的条件并不完全一致。张振等研究耐盐节杆菌(

  17]。菌株PYR2在偏碱性条件下能稳定分泌IAA,其结果和张东艳等[18]报道的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis) HS10菌株最适积累IAA的条件为偏碱性环境一致。本研究之后发现,盐浓度对菌株PYR2的生长及IAA合成量影响很大,PYR2菌株在盐浓度0.5%以下时,菌体生长量及IAA产量最高,在2% NaCl的培养基中生长状况良好,但IAA的合成受到明显抑制;当盐浓度达到3%以上时,菌体几乎不生长,也几乎不合成IAA。微生物的耐盐性和菌株自身特性有关,菌株PYR2属于Chryseobacterium属,已报道该属虽然只有两个种来源于海洋环境,但该属大部分菌株可以耐受一定浓度的盐,在含NaCl 1.95%的Difco海洋2216培养基上生长[19]。本实验中,在添加不同浓度色氨酸底物的培养条件下,菌体的OD600值在0.7−0.8之间,表明菌体的生长基本不受添加色氨酸底物浓度的影响;IAA产量和色氨酸底物浓度有关,在不加入色氨酸底物的培养基中,菌株产IAA的量为2.8 mg/L,在添加50 mg/L的L-色氨酸后,IAA合成量约为9.9 mg/L,是前者的3.5倍,继续提高色氨酸底物浓度后,IAA的合成量并未随着底物浓度的增加而提高,可能的原因是实验中采用的是1/10稀释的TSB液体培养基,培养基中含有的碳源和氮源较少,属于寡营养培养基,随着菌株的生长,碳源和氮源耗尽,限制了菌株合成IAA的能力。优化条件后,IAA产量提高了约1.5倍;IAA主要积累于菌体生长的稳定期后期,这是由于IAA是细菌的次级代谢产物,而菌体在进入稳定期后会产生大量的次级代谢产物。菌体培养64 h后,IAA在培养液中增长量逐渐趋于平缓,IAA含量基本没再次出现下降的趋势,这和张东艳等报道的Bacillus tequilensisHS10积累IAA的特性

  18]不一样,HS10菌株在稳定期大量积累,在稳定期后期IAA含量慢慢地减少,产生非常明显下降趋势,分析认为HS10在菌体生长稳定期后期,由于细胞死亡产生降解游离IAA的酶,使IAA含量下降。已报道的一些IAA产生菌的IAA产量较高,如Arthrobacter pascensZZ21的IAA最大产量为92.31 mg/L

  17],Bacillus tequilensisHS10的IAA最大产量为52.03 mg/L[18],产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) SG-11的IAA最大产量为47.4 mg/L[15]。与已报道的IAA产生菌相比,PYR2菌株在IAA产量方面并无优势,优化培养条件后IAA最大产量为18.3 mg/L,但上述这几株菌都是采用营养丰富的LB培养基培养,而本研究采用的是寡营养培养基,寡营养培养基中营养的东西的缺乏会极大限制菌株产IAA的能力。与已报道菌株采用营养丰富的LB培养基相比,寡营养条件下细胞具有更灵活的基因调控机制和酶活控制策略,细胞衰老死亡及产生的IAA降解酶分泌较少[20]。考虑到土壤属于寡营养环境,因此,采用寡营养培养基可能会更接近土壤的培养环境。要强调的是,菌株PYR2在不添加色氨酸的培养基中也能较好合成IAA,产量可达2.8 mg/L,明显高于其他已报道的菌株,如产酸克雷伯氏菌SG-11 (1.2 mg/L)和巴西固氮菌Sp7 (0.5 mg/L)[15],说明菌株PYR2在实际应用中更具有优势。3.3 PYR2菌株生物合成IAA的代谢途径据报道,一种微生物体内有几率存在一条或多条IAA合成途径

  22]。IPyA途径是植物合成IAA的重要方法,在多种细菌中也发现了该途径,包括成团泛菌(Pantoea agglomerans)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、根瘤菌(Rhizobiumsp.)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumsp.)、固氮螺菌(Azospirillum)、蓝细菌(Cyanobacteria)等。IPyA途径中,L-色氨酸先在色氨酸氨基转移酶的作用下脱去氨基转变为IPyA,接着由吲哚丙酮酸脱羧酶(IPDC)催化生成吲哚乙醛(IAA1d),后者在吲哚乙醛氧化酶的作用下生成最终产物IAA[23-24]。本实验利用LC-MS和LC-MS/MS-MRM对PYR2菌的代谢产物进行了定性分析,根据结果得出,PYR2菌能产生IAA,并且检测到TAM、IAM和TOL三种中间代谢产物。在细菌体内,除IAA生物合成过程中能形成TAM、IAM和TOL外,其它代谢过程不形成这几种产物,其中TAM和IAM是IAA生物合成途径中的直接中间产物,表明菌株能以TAM及IAM这两条途径合成IAA,而TOL是IAA生物合成途径中的间接中间产物,IPyA代谢途径中产生的IPyA和IAAld很不稳定,难以检测,但IAAld能可逆性地转化为TOL,因此,TOL的存在同样证明了菌株能以IPyA代谢途径合成IAA[15]。本研究根据LC-MS及MRM实验结果,推测PYR2体内存在3条IAA合成途径,分别是IPyA途径、TAM途径和IAM途径。